細菌、真菌、病毒等病原微生物威脅著人類健康, 全球每年因食品沙門氏菌污染而患病的有數百萬人, 機會致病真菌新生隱球菌每年導致數十萬人死亡, 病毒造成全球近 700 萬人喪生。準確鑒別致病微生物是發現和防治食品安全危害和重大傳染病的重要先決條件。目前通用的病原微生物檢測方法基于核酸擴增, 食品的基質復雜且種類不一, 如何從食物樣本中快速、高效地提取病原微生物核酸是亟需解決的技術挑戰, 已成為核酸快速檢測的限速環節。微生物核酸通常包裹于堅固的細胞壁內, 細菌細胞壁主要成分是肽聚糖, 革蘭氏陰性細菌的細胞壁肽聚糖含量較少(僅 1~2 層), 而革蘭氏陽性細菌的細胞壁由厚達 40~80 nm 的多層肽聚糖(15~50 層)組成, 其細胞壁厚度也遠高于革蘭氏陰性細菌。真菌細胞壁由多糖和蛋白質組成, 主要包括幾丁質、葡聚糖和甘露聚糖/半乳甘露聚糖。基于此, 細菌和真菌核酸提取相對困難。病毒是結構簡單的非細胞型微生物, 主要由蛋白質外殼和核酸組成。病毒的蛋白質外殼稱為核衣殼, 由殼粒組成, 對病毒核酸起保護作用, 且介導病毒核酸侵入宿主細胞。病毒蛋白外殼相對脆弱, 核酸提取過程較為容易。
核酸提取微流控芯片
微流控芯片可在微米、毫米尺度完成分離、轉移、萃取、吸附、洗滌等復雜的單元操作, 實現蛋白質和核酸等復雜分子的分離和檢測。基于液滴的微流體技術有高通量、并行化、集成化的優勢, 已被廣泛用于生物檢測, 如癌癥生物標志物、細胞外分泌物等。為構建適用于現場化的病原微生物檢測方法, 微流控芯片的自動化、集成化及高通量過程提供了良好的改進手段, 其設計原理大致如所示。目前, 已有多種核酸提取方法與微流控裝置組合使用, 可簡化操作過程、減少試劑用量、提高檢測效率
微型磁珠微流控芯片
OH 等開發了一種全集成的自動離心微流控裝置用于多重食源性病原體檢測, 該檢測裝置使用微型珠子輔助提取 DNA, 提高了樣品的處理能力。將磁珠與微芯片相結合對水傳播病原體進行 DNA 提取和檢測, 該方法第一次使用嵌入式振動裝置在 180 Hz 下對芯片上細胞進行裂解, 裂解效率約為 97%。裂解釋放后的 DNA 會與殼聚糖涂覆的納米磁珠結合形成復合物, 再用洗滌液除去細胞碎片和蛋白質等得高純 DNA, 提取效率接近 100%。與 TRIzol 法相比(2 h), 該系統提取僅需 15 min 且 DNA 質量相近, 并且具有操作簡單、耗時短和高靈敏度的優點。GOWDA 等組合磁珠和硅基研磨珠, 將核酸提取過程設置于碟式芯片上, 完成從核酸提取、純化、擴增的全流程僅需 1 h。利用磁珠法制備的微流控芯片, 其裂解、抽提、純化、檢測等步驟均可集成一體, 具有較大應用空間, 但該過程不易滿足高通量檢測要求。
超聲波微流控芯片
超聲波微流控芯片利用表面聲波振蕩驅動含細胞微滴碰撞芯片表面來破壞細胞膜的原理, 釋放細胞內的蛋白質和核酸。ZHANG 等開發了一種可在 1 min 內從血清樣品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片, 該芯片配備壓力驅動彈性膜閥, 將微流控通道分成多個室(試劑儲存室、反應室), 其核心提取部件為超聲波細胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。該方法效率高, 樣品消耗低, 可在醫院或生物實驗室中預處理少量測試樣本。 超聲波微流控芯片利用表面聲波振蕩驅動含細胞微滴碰撞芯片表面來破壞細胞膜的原理, 釋放細胞內的蛋白質和核酸。ZHANG 等開發了一種可在 1 min 內從血清樣品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片, 該芯片配備壓力驅動彈性膜閥, 將微流控通道分成多個室(試劑儲存室、反應室), 其核心提取部件為超聲波細胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。該方法效率高, 樣品消耗低, 可在醫院或生物實驗室中預處理少量測試樣本。
總結
雖然分子檢測技術飛速發展, 多種核酸擴增技術日益成熟, 但核酸快速提取技術相對落后, 已成為病原微生物現場化檢測亟需解決的痛點問題。病原微生物的核酸提取過程, 實質上是將細菌、真菌、病毒的細胞壁、細胞膜或蛋白質外殼破碎, 使其內的核酸釋放且收集純化的過程。本文從病原微生物微觀結構著眼, 概述了病原微生物細胞裂解、核酸提取、核酸純化等全過程大致發展趨勢, 總結了快速化提取病原微生物核酸的創新方法及其適用范圍。物理裂解法依賴超聲波、機械剪切力等相關設備, 且得率相對低, 成本較高; 化學裂解法快速高效, 但對核酸損傷較大, 不利于精確核酸分析; 酶法裂解特異性強, 獲取核酸質量和得率高, 但消耗時間較長。固相萃取快速高效、性價比高, 是應用潛力最大的核酸純化方式之一, 其中纖維素紙基法具有代表性。綜上所述, 病原菌核酸快速提取方法未來可能有三大突破方向。第一, 開發高親和力吸附核酸的新型載體(如凹凸捧土), 綜合各種裂解方法的優勢, 組合創新成為優質高效方法。本團隊融裂解、提取和純化三過程為一體, 正研發一種集成堿熱裂解和固相萃取相結合的快速提取方法, 實現一步法高效核酸提取, 現已完成了相關驗證和配套提取裝置的研發(待發表)。第二, 根據食品基質的來源或后續核酸擴增方法的不同, 優化設計出針對性核酸提取方法。例如, 植物基質食品采用裂解條件相對劇烈的方法, 而動物性食品采用相對溫和的提取方法。PCR 選用核酸純度較高的方法, 而 LAMP 用粗提核酸即可。第三, 在上述提取方法研究的基礎上, 開發更為精巧微流控芯片, 進一步降低試劑消耗, 提升核酸提取的樣本通量, 增加提取過程的自動化程度, 未來在病原微生物檢測領域中有巨大潛力。
4. 采用微流控制備脂質體納米粒的優勢
脂質體納米粒LNP的傳統制備方法包括沉淀法，乳化法，溶劑蒸發及超聲波處理等方法，但是傳統制備方法存在粒徑分布廣和批間重復性差的問題，對藥物開發的臨床試驗和生產具有很大影響。而微流控技術是作為制備納米脂質體的因為就具有以下優勢而引起人們的極大關注
采用微流控制備脂質體納米粒的優勢包括：
? 縮短混合時間
? 提高均一性
? 單分散性高（PDI低于0.2）
? 高通量和連續生產
? 納米顆粒生產的集成和自動化
? 通過精確的流速控制，可實現多種粒徑的單分散納米顆粒
? 多次制備的重復性好
? 使用同一套流量控制系統合成小體積（μL）和大體積（L）的脂質體納米粒
5、影響脂質體納米粒合成的因素
大部分納米脂質體應用都用于抗癌藥物，mRNA，siRNA等包封。納米顆粒的大小決定包封分子數量，并影響LNP 與細胞組織的相互作用及釋放動力學，粒徑的微小差異都可以引起藥物遞送效率的極大不同。此外，粒徑大小分布也會引起包封和釋放效率的不同，因此精確控制納米脂質體顆粒的大小和具有低的粒徑分布是及其重要，微流控技術可以精確控制流體的大小和兩相的比例，從而精確控制粒徑的大小和分布。
合成脂質體納米粒非常重要部分是實現有機相和水相的快速混合，混合的效率和均一性越好，獲得脂質體納米粒的大小和分布越精確。
目前常采用兩種類型的微流控芯片進行納米脂質體的合成，一種是魚骨形芯片，一種是流動聚焦型芯片，這兩種芯片可以實現有機相和水相的控制和快速混合，乙醇相的快速稀釋可獲得小粒徑的LNP。
納米脂質體顆粒的大小不僅取決于所用芯片，而且受脂質體溶液組成（類型，分子量大小，濃度等）和水溶液組成（pH，鹽濃度，表面活性劑）以及兩相流速比（FRR）及總流速（TFR）的影響。
FRR( flow rate ratio)是指水相流速和有機相流速的比，是制備LNP 重要的參數，依據經驗較高的流速比會合成較小的納米脂質體，尤其采用流動聚焦芯片時，FRR影響更大，而使用人字形芯片是，FRR 影響較小。
TFR（total flow rate）是指水相和有機相和流速之合，當使用流動聚焦芯片是，TFR 影響較小，而使用魚骨形芯片時，提高TFR會降低混合時間，從而使得LNP顆粒變小。
有機相中脂類的組成及脂類的濃度也是覺得脂質體顆粒大小的重要因素，一般情況下，高的脂類濃度會合成較小的LNP。其他影響因素還包括pH值，溫度，緩沖液組成等。
6、脂質體納米粒合成系統組成
脂質體納米粒合成系統需要流量控制系統和微流控芯片，具體包括2通道的OB1 壓力驅動的流量控制器，2個流量傳感器，2個儲液管以及微流控芯片。采用魚骨形微流控芯片和流動聚焦微流控芯片的具體連接如下圖：
此脂質體納米粒合成系統的原理是，連接至壓力源的壓力控制器提供一個穩定的壓力數值，通過管線為密封儲液管施加固定的壓力，從而將儲液管中的液體穩定的輸出，并經過流量傳感器，流量傳感器測定流量并反饋給壓力控制器，從而達到精確流量控制的目的，隨后流體被穩定、精確的輸送到微流控芯片中，具體參數可通過電腦上的軟件進行控制設定。2通道的壓力控制器分別控制含脂質的乙醇相和水相溶液，兩相溶液可以分別調節流速，經過流量傳感器和阻尼器后在微流控芯片中混合，從而合成納米脂質體，具體可以通過調節乙醇相及水相的流速，流速比及總流速，獲得固定粒徑大小的納米脂質體
與注射泵相比，此系統中的壓力驅動控制器具有壓力穩定性好，流量精確度高，無脈動，穩定時間短，相應速度快等優點，是微流控系統中性能最佳的流量控制器，是制備納米脂質體顆粒的理想用泵。
此微流控系統是專為研究者設計的脂質體納米粒合成系統，即便沒有微流控和納米脂質體合成經驗的研究者可以輕松合成納米脂質體。依據簡單直觀的操作指南可以精確控制納米脂質體合成的參數，以100ul/min-30ml/min流速連續合成脂質體，可獲得60-250nm高分散性的納米顆粒。此系統可以根據客戶需求合成脂質體和固體脂質體粒以及其他類型的納米顆粒。
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